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  龋病是一种由多因素所致，发生在牙体硬组织的细菌感染性疾病。与大多数表现出经典致病毒力因子的感染性疾病不同，龋病的病因独特，致龋微生物是其中最重要的因素，表现为致龋菌在牙面形成牙菌斑生物膜，代谢碳水化合物产酸，造成牙体硬组织无机物脱矿和有机物分解。变异链球菌是公认的主要致龋菌，与人类龋病密切相关。

 龋病是一种由多因素所致，发生在牙体硬组织的细菌感染性疾病。与大多数表现出经典致病毒力因子的感染性疾病不同，龋病的病因独特，致龋微生物是其中最重要的因素，表现为致龋菌在牙面形成牙菌斑生物膜，代谢碳水化合物产酸，造成牙体硬组织无机物脱矿和有机物分解。变异链球菌是公认的主要致龋菌，与人类龋病密切相关。

 抑制变异链球菌毒力相关的基因和酶，能够影响毒力因子的产生，降低细菌致龋能力，有助于龋病的预防和治疗。细胞壁是细菌所特有的结构，对维持细菌固有形态、抵抗外界压力和表达细菌毒力因子等生命活动至关重要，因此在寻找有效的抗菌药物时细胞壁是理想的药物作用靶点。肽聚糖是变异链球菌细胞壁的核心结构，谷氨酸消旋酶(Glutamate racemase，MurI)(EC5.1.1.3)为肽聚糖骨架成分右旋谷氨酸(D-glutamate)合成的关键酶。由于在人体中不存在此种代谢途径，MurI可能成为研制预防龋病药物的作用靶点之一。

一、谷氨酸消旋酶

 变异链球菌为革兰氏阳性菌，这类细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，是原核生物细胞所特有的物质。肽聚糖由聚糖骨架、四肽侧链和五肽交联桥三部分组成，聚糖骨架由N-乙酰葡糖胺(N-acetyl glucosamine，GlcNAc)和N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid，MurNAc)交替间隔排列，经 -1，4糖苷键联结而成。四肽侧链由L-丙氨酸、D-谷氨酸、L-赖氨酸和D-丙氨酸依次排列组成;第三位的L-赖氨酸由5个甘氨酸组成的五肽交联桥连接到相邻聚糖骨架四肽侧链末端的D-丙氨酸，从而构成机械强度十分坚韧的三维立体结构。D-谷氨酸掺入到四肽侧链的第二个残基上在原核生物中是高度保守的。

 功能性D-谷氨酸是由MurI通过改变同名L-谷氨酸立体化学式结构生成的。MurI是一类不需辅助因子，专一催化L型和D型谷氨酸之间相互转化的酶，为细胞壁合成提供D-谷氨酸，是细菌生长的关键酶。MurI大多分布在原核生物的细胞质中，自1952年，Ayengar和Roberts首次报道在阿拉伯乳杆菌中发现MurI以来，相继从大肠杆菌、粪肠球菌、化脓性链球菌、幽门螺旋杆菌、芽孢杆菌属以及分支杆菌属等证实存在该酶。

 目前发现的谷氨酸消旋酶包括两种类型，为RacE/YprC和MurI，前者由racE/glr 和yprC 基因编码，后者由murI 基因编码。RacE/YprC参与肽聚糖和 聚D-谷氨酸的合成，主要存在于芽孢杆菌属。 聚D-谷氨酸是由D-谷氨酸和L-谷氨酸单体通过酰胺键连接而成的一类均聚氨基酸，是炭疽杆菌的重要致病毒力因子之一。MurI为菌体合成肽聚糖提供D-谷氨酸，多数原核细菌表达该类MurI。由于MurI只分布在原核生物，在高等真核生物中不存在，因而成为目前研究和开发新型抗菌药物的新靶标。

二、谷氨酸消旋酶的结构特征及活性检测方法

 MurI蛋白的四级结构主要存在2种类型：单体和同源二聚体。大肠杆菌的MurI 通常是单体，幽门螺杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌和葡萄球菌等则是由相同多肽链组成的同源二聚体。MurI的催化活性由于其四级结构不同而存在很大差异。从已经解析的革兰阳性菌MurI(MurIG+)的结构可以看出，该酶是由二聚体构成的蛋白结构，2个单体的N端结构域通过极性作用和疏水作用尾尾相连沿铰链轴(hingeaxis)对称排列。每个单体由2个结构域构成，N端93-199位的氨基酸残基构成( )9 三明治结构：2个 螺旋( 10-1)、4个 折叠( 5-)和3 个 螺旋( 6-);C 端结构域(1-90、200-252 位的氨基酸残基)与N端相似，6个呈平行排列的 折叠位于中间( 1-、 9-0)，两侧分别被4个 螺旋( 1-2、 12-3)和2个 螺旋( 3、 5)包围。在序列的N端，存在Asp7、Ser8、Cys70和Thr72保守氨基酸位点参与D-谷氨酸去质子化过程;在序列的C端，含有Glu150、Cys181、Thr182、His183的催化残基位点参与L-谷氨酸去质子化反应。

 这些位点在MurI氨基酸序列保守存在，常作为定点突变的靶标。Gallo和Knowles对发酵乳杆菌的MurI晶体结构进行研究，发现MurI含有2个重要的催化活性位点：半胱氨酸残基Cys73和Cys184;通过定点突变和动力学研究，证实Cys73和Cys184的催化作用是：以L-谷氨酸为底物时，Cys73提供 -质子(去质子化)，Cys184从L-谷氨酸吸收 -质子(复质子化)，形成D-谷氨酸，在这个反应中Cys73为质子供体，Cys184为消旋反应的质子受体;反之则反。值得注意的是，消旋反应中2个半胱氨酸残基分别来源于2个不同的单体，而不是存在于同一个单体，说明MurI在结构和功能上属于二聚体类型;而近年通过晶体结构解析则证实了除大肠杆菌外，几乎所有被解析的MurI均由同源二聚体构成，这为合理设计抑制剂提供了理论依据，即设计特异性抑制剂占据活性位点或阻碍单体聚合形成二聚体，最终抑制酶蛋白的活性。

 目前，检测MurI活性的方法主要有2种，一是应用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)，利用手性色谱柱，定量分析D-谷氨酸在MurI催化作用下生成L-谷氨酸的量。第二种方法是先后应用2个级联酶促反应，在第一个反应中D-谷氨酸在MurI的外消旋作用下，生成中间产物L-谷氨酸;后者在第二个氧化还原反应中，与氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(又称辅酶I，NAD+)在谷氨酸脱氢酶催化作用下，生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(又称还原型辅酶I，NADH)、 -酮戊二酸和氨水。NADH在波长340 nm处可检测到吸收峰。由于第二种方法具有高效、简便、快速等优点，目前已成为高通量筛选酶抑制剂(highthroughput screening，HTS)的主要方法。

三、谷氨酸消旋酶抑制剂的研究进展

 根据抑制剂作用机制的不同，MurI抑制剂主要分为3种：底物类似物、别构抑制剂、大分子抑制剂。底物类似物是不可逆性抑制剂，它们在结构上具有与底物相似的基团，能够竞争酶结合位点，从而影响酶和底物的正常结合。最主要的是，底物类似物存在一个或数个化学反应性基团，当酶遇到这类抑制剂时，底物相似基团会携带抑制剂进入酶的活性中心，具有化学反应性的基团则可以跟酶活性中心的氨基酸残基产生反应，共价修饰活性中心，导致酶不可逆地失活。L-serine-O-sulfate(LSOS)、Aziridino-glutamate和D-N-hydroxyglutamate是针对戊糖片球菌和发酵乳杆菌MurI的底物类似物，它们的作用机制是：来源于LSOS 的-OSO2H、Aziridino-glutamate 的氮丙环(HN )和D-N-hydroxyglutamate的-NHOH化学反应基团，与MurI上的硫醇基(-SH)共价结合，产生酶-抑制剂复合体从而抑制酶的活性。别构抑制剂是指能与酶蛋白分子活性中心以外的某一部位(别构位点)特异结合，引起酶蛋白分子构象变化导致酶活性降低的一类小分子化合物。

 别构抑制剂对酶的这种调节作用通常是可逆的，原因在于小分子化合物与别构位点是非共价键结合。传统底物类似物(靶向于活性中心结合位点)基本上都具有典型的相似性化学骨架，而基于不同构象的别构位点，MurI别构抑制剂则呈现出化学结构的多样性，更适合新药的研发。Lundqvist等运用高通量药物筛选方法，发现了一类幽门螺杆菌MurI别构抑制剂，这类抑制剂衍生于吡唑并嘧啶(Pyrazolopyrimidinediones)，具有非时间依赖性、特异性和可逆性等特点，利用核磁共振和X射线衍射晶体分析法对抑制剂-酶结合复合体进行研究，证实抑制剂结合在酶的位点上导致第252位色氨酸残基发生构象改变。de Jonge等通过体外抑菌试验进一步证实吡唑并嘧啶衍生物能够抑制MurI活性导致细胞壁肽聚糖合成受阻。

 由于具有选择性好、安全性高和动力学缓慢等优势，越来越多的MurI别构抑制剂被设计和研发出来，为临床耐药细菌抗菌药物的研发提供了广阔的前景。Choi 等发现氯化血红素亦存在MurI活性抑制作用，由于氯化血红素分子量大于650，故将其归类于大分子抑制剂(底物类似物和别构抑制剂均为小分子抑制剂)，通过光谱研究结果表明，氯化血红素可以与戊糖片球菌MurI形成稳定的复合体结构，使酶完全失活。

四、谷氨酸消旋酶基因缺失突变株的研究进展

 研究表明，抑制细菌细胞壁合成所需的酶或对其编码基因进行突变，对细菌通常是致死的或可导致细菌毒力缺陷。

 近年来，对缺失murI基因与细菌存活的研究，文献虽已有报道但结论并不一致。murI 基因是大肠杆菌WM335和结核分枝杆菌ATCC 27294生长所必需的基因，敲除该基因后，均导致致死表型;耻垢分枝杆菌mc2155 murI 突变株能存活，然而生长会受到抑制、细胞发生膨大等形态改变，且研究显示突变株的形态及存活与培养基的成分及物理状态密切相关。Oh等通过温度敏感型质粒构建炭疽芽孢杆菌racE基因突变株，发现在炭疽芽孢杆菌中同时敲除racE 的2个同源基因racE1/racE2 导致致死表型;单独敲除racE1 或racE2不致死，但racE2 基因缺失后细菌呈现出生长缓慢，孢子萌发滞后、形成孢子能力下降等表型，细胞形态也发生异常，细胞壁 聚D-谷氨酸含量减少。本课题组前期研究工作中成功构建变异链球菌murI 缺失突变株，从表型和基因转录水平研究证实，缺失murI 负向调控变异链球菌致龋毒力因子的表达，突变株的生理特性、致龋毒力因子的表达和对外界不利环境的耐受程度均不同于野生株，这些特性改变提示MurI有望成为预防龋病的作用靶点。

 研究表明，MurI在相同菌属的氨基酸序列中具有高度保守性。通过生物信息学分析，变异链球菌UA159 MurI氨基酸序列与变异链球菌GS-5、唾液链球菌、血链球菌、轻型链球菌和消化链球菌的MurI 具有65% ~ 99%的同源性。研究已证实，这6种口腔链球菌与牙面各部位龋的发生发展密切相关，这为以MurI 为靶标，深入了解细菌的致病机制、作用机理和研发新型抗龋药物等提供了新的理论依据。